发表期刊：Molecular Cell
影响因子：14.548
实验方法：m7G MeRIP seq、m7G MeRIP qPCR、RNA-seq等
1. 肺癌细胞系A549特异性miRNA中m7G的检测
作者用抗体富集法m7G MeRIP seq（云序提供此服务）鉴定肺癌细胞系A549中含有m7G的成熟miRNA。挑选其中高度富集的miRNA进行MeRIP-qPCR（云序提供此服务）验证，发现其中五个miRNA确实存在m7G修饰。
前期研究发现RNA甲基化酶METTL1介导tRNA的m7G修饰，于是作者开始研究METTL1对前面鉴定到的miRNA（如let-7e-5p）的m7G修饰的影响。在A549细胞中敲除METTL1，发现m7G甲基化修饰下调的miRNA比上调或不变的miRNA多，并且这种下调可以通过回补METTL1的表达来挽救。
METTL1敲除后，m7G甲基化修饰下调的miRNA大部分与细胞迁移功能相关，因此作者推测METTL1可能通过调控miRNA（包括let-7家族）影响细胞迁移功能。为了探索这种可能性，作者首先测试了METTL1是否影响A549细胞的迁移。结果发现，敲除METTL1可明显增加A549迁移能力，但不影响细胞增殖。后期作者又进行回补实验，发现回补METTL1后细胞迁移能力下降。
为了研究METTL1敲降后，差异表达的基因与m7G修饰的miRNA之间的关系，作者挑选了HMGA2进行进一步研究，它是METTL1敲降后上调明显的基因之一，其3’ UTR区显著富集了几个含有m7G的miRNA的结合位点，包括let-7（5p）、miR-125（5p）和miR-92（3p）。
首先，作者证实METTL1基因敲除可增加细胞中HMGA2的mRNA表达和蛋白质水平。接着作者通过荧光素酶实验，证实METTL1通过3’UTR对HMGA2的表达产生影响。为了证实METTL1对HMGA2的3’UTR的调节是通过miRNA的作用介导的，作者重点了研究含有m7G甲基化修饰的let-7，它在HMGA2的3’UTR中有7个结合位点，删除let-7种子序列后，两者无法结合，荧光素酶活性增加，并且METTL1失去对HMGA2的调节作用。随后作者做回补实验发现，METTL1敲降引起的HMGA2蛋白的上调，可以通过回补成熟let-7e-5p miRNA进降低。这些数据证实METTL1确实通过let-7调节HMGA2的表达。
那么问题来了，METTL1是如何影响let-7的呢？作者通过紫外交联和免疫沉淀（CLIP）证实METTL1直接结合到miRNA的前体，进一步研究发现METTL1影响miRNA（如let-7e-5p）成熟体的表达（非miRNA前体），并排除METTL1对剪接因子的影响。接下来通过RIP实验、体外剪接和甲基化转移酶活性实验等研究发现METTL1对miRNA（如let-7e-5p）成熟的影响是直接的、且依赖于m7G修饰的。
为了探讨let-7e的m7G甲基化如何影响其体内加工的机制，作者通过靶向质谱确定let-7e-5p中m7G修饰的位点实G11。生信分析发现G11所在位置是GG-四联体结构（G-quadruplex，G2+N4G2+N4G2+N4G2+），为了探讨G-四联体与m7G之间的联系，作者分析了含有m7G的miRNA的碱基组成，评估了G-四联体基序的潜在富集，发现G四元结构在METTL1影响的发生m7G修饰的miRNA中都存在。
那么G-四联体结构与m7G修饰的关系是怎样的？作者进一步通过圆二色谱、变性实验和序列突变等实验进行研究。结果观察到，G11突变通过将结构平衡转移到典型的茎环结构来影响pri-let-7e的折叠。相比之下，G4和G5突变对结构平衡没有明显影响。这些结果表明，G11的甲基化有不利于let-7e的茎环结构平衡。
接下来，作者使用含DAG的pri-let-7e发夹寡核苷酸来确定诱导的结构变化是否影响体内miRNA的加工，结果发现在G11处的pri-let-7e甲基化通过破坏局部G-四链结构促进其加工。
作者首先通过m7G MeRIP seq找到肺癌细胞系中特异性的发生m7G修饰的miRNA，并对其验证。随后作者发现METTL1甲基化酶介导的m7G通过破坏G-四联体影响茎环结构的稳定性，从而促进其从pri-到pre-miRNA的过程，最终导致miRNA成熟。成熟的miRNA通过结合下游靶基因，抑制细胞迁移，从而抑制肺癌。
图8 m7G在miRNA生物合成中的作用
云序生物提供两种m7G RNA甲基化测序服务：（1）m7G RNA甲基化单碱基测序，可对m7G修饰进行高通量检测和单碱基定位；（2）MeRIP测序，可通过m7G特异性抗体，抓取有甲基化修饰的片段进行测序，对m7G修饰进行高通量测序和peak峰定位。此外，云序生物针对m7G RNA甲基化开发了多款产品，可实现对mRNA、LncRNA、pri-miRNA、tRNA和rRNA等多类RNA分子的m7G甲基化修饰水平的全面检测。
实验流程
m7G RNA甲基化单碱基测序实验流程图
m7G MeRIP测序实验流程图
样本要求
样品类型
细胞、组织或RNA，其他样本类型请电询。
样品量
1.单碱基测序方式：
a) 细胞：≥1×108
b) 组织：500 mg - 5 g
c) RNA：100 μg - 300 μg
2. MeRIP测序方式：
a) 细胞：≥2×107
b) 组织：100 mg - 1g
c) RNA：30 μg - 300 μg
d) 超微量RNA满足500 ng - 30 μg
样品运输：样品置于1.5mL离心管中，封口膜封好，干冰运输。
样品保存：细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存；RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。
云序优势
单碱基分辨
可对m7G甲基化修饰进行单碱基定位。
高通量检测
可对全转录组范围内的m7G位点进行高通量地平行检测。
全分子覆盖
可全面地对mRNA、lncRNA、pri-miRNA、tRNA和rRNA等多类RNA分子的m7G位点进行检测。
一站式服务
客户仅需提供组织或细胞，云序生物一站式完成RNA抽提，样品预处理，建库，测序，数据分析全套流程。
专业的生物信息学分析
专业的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析需求
云序生物RNA表观修饰
云序作为一家依托于高通量测序的表观转录组学科研服务公司，长期致力于提供优质前沿表观研究测序产品，继m6A、m5C、m1A之后，云序隆重推出多款RNA新修饰，不仅m7G测序，还包括m3C测序、ac4C RNA乙酰化测序、2'-O-甲基化RNA测序产品，打造了全面的RNA修饰研究平台。
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