circRNA和m6A再次秀恩爱携手登上Nature Communication-技术前沿-资讯-生物在线

circRNA和m6A再次秀恩爱携手登上Nature Communication

作者:上海云序生物科技有限公司 2020-01-12T10:48 (访问量:3204)

以m6A为代表的RNA修饰是近几年的热点研究方向,目前已有多篇文章报道多种RNA分子都可携带m6A的修饰。推荐往期阅读:

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m6A后宫佳丽竟然如此众多,不会独宠于一人。有趣的是不管是昨日明星miRNA分子还是今日明星之子circRNA,都能够被m6A宠幸。而且过期网红miRNA被m6A宠幸后重新焕发昔日耀眼的光芒,直接威胁到今日明星之子circRNA正宫之主的地位。今天小编带领大家看看m6A是如何携手circRNA通过环状RNA高通量技术MeRIP技术联合分析秀出新高度。

2019年10月16日,circRNA m6A修饰一文发表在Nature Communication(IF=11.878)杂志上。报道发现m6A修饰的circNSUN2可结合YTHDC1并促进出核,进一步结合IGF2BP2促进HMGA2 mRNA的稳定,最终促进结直肠癌的肝转移增强。这一成果来自于中山大学附属肿瘤医院的谢丹教授,徐瑞华教授Wang Fengwei。本文通过环状RNA高通量技术研究结直肠癌circRNA表达谱,以及结直肠癌肝转移样本分析发现circNSUN2的表达明显增高,体内实验证明circNSUN2与CRC的肝转移相关。利用RNA pull-down实验找到circNSUN2结合蛋白YTHDC1和IGF2BP2,并通过MeRIP-PCR实验证实circNSUN2存在m6A修饰,最后通过RNA测序分析出circNSUN2的靶基因HMGM2,并利用RIP实验证实IGF2BP2与HMGM2结合受circNSUN2调控。本文研究结果表明m6A修饰可调控circRNA的出核,是circRNA修饰研究的重要进展,为circRNA修饰研究提供新的方向。


m6A修饰的circNSUN2调控其出核和HMGA2稳定并促进结直肠肠癌的肝转移

发表期刊:Nature Communication

影响因子:11.878

实验方法:高通量测序技术MeRIP-qPCRRNA pull downRIP等。(以上实验云序均可提供)

实验样本:人结直肠组织vs结直肠癌组织

文章技术路线


红色标记部分:云序生物可提供服务

1. 如何筛选出circNSUN2分子的?

本文作者通过 高通量筛选技术(云序提供此项服务)分析两对结直肠癌(CRC)与癌旁组织样本circRNA表达谱,共找到13167个circRNA分子。基因组拷贝数畸变(CNV)是肿瘤发生重要的驱动因素,作者猜测该区域的circRNA与肿瘤的发生发展有关联,于是选择CRC中最常见的CNV位点,鉴定出对应位点异常表达有38种circRNA,其中9种circRNA的变化趋势在两例肿瘤标本中是一致的。为进一步分析筛选对结直肠癌更有临床意义的分子,作者在97例CRC的标本库中分析了这9个circRNA的表达情况,其中4种circRNA在超过75%的标本中呈现出高表达的趋势。在97例标本群体中,circNSUN2高表达的组生存状况显著低于低表达组,研究结果表明circNSUN2不仅在CRC患者体内高表达也在结直肠癌肝转移患者体内呈现明显上调趋势,显然circNSUN2在结直肠的发生发展中起着重要的作用。


图1. circNSUN2的筛选

2. circNSUN2的鉴定

作者利用Sanger测序、RNase R酶消化(云序生物提供此项服务)、放线菌D处理稳定性分析、亚细胞定位和FISH等实验分别从序列、结构、表达、定位对circNSUN2进行验证和鉴定,发现circNSUN2主要位于细胞质中。


图2. circNSUN2的鉴定

3. circNSUN2在CRC中功能验证

在TC17细胞或PDX模型的细胞中敲低或过表达circNSUN2,分析circNSUN2对肝转移效率的影响情况。实验结果均表明干扰circNSUN2可以降低CRC的肝转移而过表达circNSUN2则促进肝转移,circNSUN2在CRC的肝转移过程中发挥重要作用。

4. circNSUN2在CRC中功能机制探讨

一般探讨circRNA机制最先想到的是经典的海绵机制,然而海绵机制又是老生常谈,所以作者选择circRNA可能结合蛋白参与CRC调控更具有价值意义。这里就是利用分子机制研究中常用到的RNA pull-down技术(云序生物提供此项服务),分析circNSUN2结合的蛋白,经过质谱分析发现了YTHDC1和IGF2BP2,而且western blot和RIP实验(云序生物提供此项服务)都证实circNSUN2与YTHDC1、IGF2BP2的相互作用。有趣的是YTHDC1是已知的m6A修饰Reader分子之一,而IGF2BP2是一种RNA结合蛋白,与mRNA的稳定性有关,已知在CRC中与侵袭有关。那这就耐人寻味了,circNSUN2是否也存在着m6A修饰或参与mRNA的稳态呢?作者这里分别探讨circNSUN2与这两种蛋白的作用机制。

1)YTHDC1是否参与circNSUN2的m6A修饰?

作者通过MeRIP-PCR实验(云序生物提供此项服务)证明了circNSUN2确实可以被m6A的抗体富集,这也就意味circNSUN2分子上存在m6A修饰位点。而motif分析、点突变实验进一步证实了m6A修饰介导了circNSUN2与YTHDC1的相互作用。这种m6A修饰是否也是驱动circRNA翻译的呢?根据circNSUN2结合蛋白来看不是那么简单的作用,作者猜测这种修饰会影响其在亚细胞中的分布?果然FISH和YTHDC1敲低实验都证实这一点,敲除YTHDC1后核内circNSUN2的丰度明显增高了,显然YTHDC1参与circNSUN2的m6A修饰并促进其出核。


图3. YTHDC1介导circNSUN2的m6A修饰促进其出核

2)IGF2BP2与circNSUN2的结合

作者通过RNA pull-downRIP实验都证实circNSUN2与IGF2BP2的结合,为了进一步分析它们的结合,作者通过已经报道IGF2BP2结合RNA的motif分析,发现circNSUN2中也存在这样的基序,而基序位点突变分析更加确定了circNSUN2与IGF2BP2的结合。


图4. circNSUN2上motif分析

3)如何寻找circNSUN2调控的靶基因呢?

既然IGF2BP2与mRNA的稳定性有关,那么circNSUN2与IGF2BP2结合是否也会影响一些mRNA的稳定性?为了找到circNSUN2下游靶基因,作者再次利用mRNA测序(云序生物提供此项服务),敲除circNSUN2后发现有644个mRNA发生明显的差异表达。而且已知IGF2BP2通常结合mRNA 的3’UTR区富含AU的序列,利用这一点,进一步筛选出21个mRNA可以结合IGF2BP2,而且q-PCR发现在CRC肝转移患者内HMHA2是异常高表达。RNA pull-down 、荧光素酶实验、免疫荧光-FISH共定位等实验分析进一步证实了circNSUN2/ YTHDC1/IGF2BP2复合体与HMGA2 mRNA的结合,可见circNSUN2调控的靶基因是HMHA2。


图5.circNSUN2/ YTHDC1/IGF2BP2复合体与HMGA2的结合

4) HMHA2功能验证

最后,作者在小鼠体内模型中验证了上述分子模型与CRC肝转移的相关性。实验结果表明单独干扰circNSUN2可抑制肝转移,但如果同时过表达HMGA2则促进肝转移。

图6. HMGA2是circNSUN2调控CRC肝转移的介导者

总结:

在小编看来,本文的亮点是作者巧妙的利用RNA测序RIP技术RNA pulldown技术MeRIP技术关联分析揭示了circRNA m6A修饰的功能机制,RNA甲基化和明星之子circRNA强强联手出新高度。那么本篇文章在通过高通量筛选出目的环状RNA之后,经过多次实验一步步证明环状RNA存在m6A修饰,中间历经了九九八十一难,小编在此基础之上,为大家推荐了快速找到发生m6A修饰的环状RNA的方式。云序生物的全转录组测序联合m6A测序,可以快速找到发生m6A修饰的环状RNA、lncRNA、mRNA,快速牟定了发生m6A修饰的关键靶基因,一步到位。无论您关心哪种RNA分子的m6A修饰,云序生物m6A-全转录组都将一网捕获。

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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6795808/

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